探針法熒光PCR檢測試劑盒的優(yōu)勢和測量原理
探針法熒光PCR檢測試劑盒的熒光PCR是使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行的核酸同步擴(kuò)增和檢測/定量的方法。
探針法熒光PCR檢測試劑盒具有顯著的優(yōu)勢，可以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的精確定量。特異性好，大大降低了檢測的假陽性，靈敏度高，采用靈敏的熒光檢測系統(tǒng)對熒光信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，操作簡單，無PCR產(chǎn)物污染。省去了最麻煩的基因序列查詢、引物探針設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化等大量費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、費(fèi)錢的繁瑣工作。探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴(kuò)增結(jié)合的問題，反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
探針法熒光PCR檢測試劑盒的原理在于PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收。正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與該探針同時(shí)結(jié)合到模板上，探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比，因此，根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強(qiáng)度即可計(jì)算出初始DNA模板的數(shù)量。
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